IChO 1984 · Theory problem 8

Amino acid sequence of a pain-relieving peptide

Download PDFIChO 1984

The sequence of the amino acids in a peptide can be determined by a combination of chemical and enzymatic methods. The peptide in question functions in the human body as a pain reliever.

a) Hydrolysis of the peptide in 6 M \(\ce{HCl}\) at \(110^\circ\mathrm{C}\) followed by an analysis of the liberated amino acids, resulted in a molar ratio of Gly, Leu, and aromatic amino acids Phe, Tyr 2 : 1 : 1 : 1.

b) Reacting the peptide with 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), followed by hydrolysis and chromatographic analysis, yielded the tyrosine derivative.

c) Partial hydrolysis with chymotrypsin yielded Leu, Tyr and a smaller peptide. After hydrolysis of this peptide Gly and Phe were identified in a ratio 2 : 1. Chymotrypsin is a protease which cleaves a peptide bond following an aromatic amino acid.

Problems:

8.1 Determine the amino acid sequence from the given information.

8.2 Write the structural formula of the DNFB- and the dansyl derivative of tyrosine. What is the advantage of the dansylation in comparison to the DNFB-modification?

Dansyl means 5-N,N-dimethylaminonaphtalene-4-sulphonyl.

8.3 In a similar peptide which shows the same biological activity, leucine is replaced by methionine. Explain from the chemical structure of both amino acids why the replacement is possible without loss of biological activity.

Official English text of the problem.

Answers

8.1 The sequence, from the N-terminus to the C-terminus, is Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu, called Leu-enkephalin.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 The N-terminal sequencing derivatives are:

\(N^\alpha\)-(2,4-dinitrophenyl)-L-tyrosine, with a direct bond between the tyrosine amino nitrogen and the dinitrophenyl ring.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-dansyl-L-tyrosine, with a sulfonamide linkage. Using the conventional definition of dansyl:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

Dansyl derivatives are strongly fluorescent, permitting much more sensitive detection and therefore sequencing with smaller quantities of peptide. The printed dansyl locants are addressed below.

8.3 L-Leucine, N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O, and L-methionine, N[C@@H](CCSC)C(=O)O, have uncharged, predominantly hydrophobic side chains of comparable bulk. Their substitution can therefore preserve the interactions required for biological activity.

Solution

8.1 — Determination of the sequence

The amino-acid composition is:

Residue	Number in the pentapeptide	Free amino acid: name and SMILES
Gly	2	Glycine: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-Leucine: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-Phenylalanine: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-Tyrosine: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

DNFB reacts with the free N-terminal amino group. The identification of its tyrosine derivative after hydrolysis therefore places Tyr at the N-terminus.

Chymotrypsin cleaves on the C-terminal side of an aromatic residue. Here the aromatic residues are Tyr and Phe.

Cleavage immediately after the N-terminal Tyr releases free Tyr.
Free Leu must be the C-terminal residue: an internal Leu could not be released as a single amino acid because this would require cleavage after Leu, contrary to the stated specificity.
Consequently, the bond immediately before the terminal Leu must follow an aromatic residue. Tyr is already at the N-terminus, so this residue is Phe.
The remaining fragment contains two Gly and one Phe. Since Phe must end this fragment, its order is Gly–Gly–Phe.

Thus the cleavage pattern is

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

The smaller peptide is glycylglycyl-L-phenylalanine:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

Each hydrolysed peptide bond consumes one molecule of water, O. Using sequence abbreviations for peptides with free termini, the balanced enzymatic hydrolysis is

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

Hydrolysis of the smaller peptide gives

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

in agreement with the observed \(2:1\) ratio. Complete hydrolysis of the original peptide breaks four peptide bonds:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

These balances use neutral molecular forms; the amino groups are protonated in the strongly acidic hydrolysis mixture.

8.2 — Structures and advantage of dansylation

Let \(R\) denote the tyrosine side chain,

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

with the phenolic \(\ce{OH}\) para to the \(\ce{CH2}\) group.

DNFB derivative. The reagent is 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-].

The amino nitrogen replaces fluorine by nucleophilic aromatic substitution. The neutral-form reaction is

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

The formal by-product is hydrogen fluoride, F; base neutralizes it during derivatization.

To draw the product, attach the tyrosine amino nitrogen directly to carbon 1 of a benzene ring bearing nitro groups at positions 2 and 4. The nitrogen retains one hydrogen, and the tyrosine phenolic hydroxyl remains present in this \(N^\alpha\)-labelled structure.

Dansyl derivative. Conventional dansyl chloride, or 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride, has SMILES:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

The amino nitrogen replaces chlorine at sulfur, forming a sulfonamide:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

The formal by-product is hydrogen chloride, Cl, which is likewise neutralized by base.

To draw conventional dansyltyrosine, place the dimethylamino group at naphthalene carbon 5 and the sulfonyl group at carbon 1. The latter has two \(\ce{S=O}\) bonds and an \(\ce{S-NH}\) bond to the tyrosine amino nitrogen.

In peptide sequencing, these reactions label the N-terminal nitrogen while the residue is still part of the peptide. Subsequent hydrolysis releases the labelled amino acid.

The advantage of dansylation is its strong fluorescence, allowing detection at much lower concentrations than the coloured dinitrophenyl derivatives.

The statement instead specifies 5-(dimethylamino)naphthalene-4-sulphonyl. Taken literally, this gives a different positional isomer, with the two substituents in peri positions. The corresponding \(N^\alpha\)-[5-(dimethylamino)naphthalene-4-sulfonyl]-L-tyrosine is:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — Why methionine can replace leucine

The side chains are

\[ \begin{aligned} \text{Leucine:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{Methionine:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

Both are flexible, predominantly hydrophobic groups of comparable size. Methionine contains an uncharged thioether, which does not introduce a charged side chain.

The substitution preserves the peptide backbone and can maintain similar hydrophobic contacts at the receptor. Thus it is chemically reasonable that replacing the terminal leucine with methionine retains the pain-relieving activity.

The solution was checked against the official solution.

IChO 1984 · Theorieaufgabe 8

Aminosäuresequenz eines schmerzlindernden Peptids

PDF herunterladenIChO 1984

Die Reihenfolge der Aminosäuren in einem Peptid kann durch eine Kombination chemischer und enzymatischer Methoden bestimmt werden. Das betreffende Peptid wirkt im menschlichen Körper schmerzlindernd.

a) Die Hydrolyse des Peptids in 6 M \(\ce{HCl}\) bei \(110^\circ\mathrm{C}\) mit anschließender Analyse der freigesetzten Aminosäuren ergab ein molares Verhältnis von Gly, Leu und den aromatischen Aminosäuren Phe, Tyr von 2 : 1 : 1 : 1.

b) Die Umsetzung des Peptids mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) mit anschließender Hydrolyse und chromatographischer Analyse lieferte das Tyrosinderivat.

c) Die partielle Hydrolyse mit Chymotrypsin lieferte Leu, Tyr und ein kleineres Peptid. Nach der Hydrolyse dieses Peptids wurden Gly und Phe im Verhältnis 2 : 1 identifiziert. Chymotrypsin ist eine Protease, die eine auf eine aromatische Aminosäure folgende Peptidbindung spaltet.

Aufgaben:

8.1 Bestimmen Sie die Aminosäuresequenz anhand der gegebenen Informationen.

8.2 Geben Sie die Strukturformeln des DNFB- und des Dansylderivats von Tyrosin an. Welchen Vorteil hat die Dansylierung gegenüber der DNFB-Modifizierung?

Dansyl bedeutet 5-N,N-Dimethylaminonaphthalin-4-sulfonyl.

8.3 In einem ähnlichen Peptid, das dieselbe biologische Aktivität aufweist, ist Leucin durch Methionin ersetzt. Erklären Sie anhand der chemischen Struktur beider Aminosäuren, warum dieser Austausch ohne Verlust der biologischen Aktivität möglich ist.

Aufgabentext aus dem offiziellen englischen Text übersetzt.

Antworten

8.1 Die Sequenz vom N-Terminus zum C-Terminus lautet Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu und wird als Leu-Enkephalin bezeichnet.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 Die Derivate zur N-terminalen Sequenzbestimmung sind:

\(N^\alpha\)-(2,4-Dinitrophenyl)-L-tyrosin, mit einer direkten Bindung zwischen dem Aminostickstoff des Tyrosins und dem Dinitrophenylring.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-Dansyl-L-tyrosin, mit einer Sulfonamidbindung. Unter Verwendung der üblichen Definition von Dansyl:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

Dansylderivate sind stark fluoreszierend, was einen wesentlich empfindlicheren Nachweis und damit die Sequenzbestimmung mit geringeren Peptidmengen ermöglicht. Auf die in der Aufgabenstellung angegebenen Dansyl-Lokanten wird weiter unten eingegangen.

8.3 L-Leucin, N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O, und L-Methionin, N[C@@H](CCSC)C(=O)O, besitzen ungeladene, überwiegend hydrophobe Seitenketten mit vergleichbarem Raumbedarf. Ihr Austausch kann daher die für die biologische Aktivität erforderlichen Wechselwirkungen erhalten.

Lösung

8.1 — Bestimmung der Sequenz

Die Aminosäurezusammensetzung lautet:

Rest	Anzahl im Pentapeptid	Freie Aminosäure: Name und SMILES
Gly	2	Glycin: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-Leucin: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-Phenylalanin: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-Tyrosin: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

DNFB reagiert mit der freien N-terminalen Aminogruppe. Der Nachweis seines Tyrosinderivats nach der Hydrolyse legt daher Tyr als N-Terminus fest.

Chymotrypsin spaltet auf der C-terminalen Seite eines aromatischen Rests. Hier sind die aromatischen Reste Tyr und Phe.

Die Spaltung unmittelbar nach dem N-terminalen Tyr setzt freies Tyr frei.
Freies Leu muss der C-terminale Rest sein: Ein innenliegendes Leu könnte nicht als einzelne Aminosäure freigesetzt werden, da dies eine Spaltung nach Leu erfordern würde, was der angegebenen Spezifität widerspricht.
Folglich muss die Bindung unmittelbar vor dem terminalen Leu auf einen aromatischen Rest folgen. Tyr befindet sich bereits am N-Terminus, sodass dieser Rest Phe ist.
Das verbleibende Fragment enthält zwei Gly und ein Phe. Da Phe am Ende dieses Fragments stehen muss, lautet seine Reihenfolge Gly–Gly–Phe.

Damit ergibt sich folgendes Spaltungsmuster:

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

Das kleinere Peptid ist Glycylglycyl-L-phenylalanin:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

Jede hydrolysierte Peptidbindung verbraucht ein Molekül Wasser, O. Unter Verwendung von Sequenzabkürzungen für Peptide mit freien Termini lautet die ausgeglichene Gleichung der enzymatischen Hydrolyse:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

Die Hydrolyse des kleineren Peptids ergibt

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

in Übereinstimmung mit dem beobachteten Verhältnis von \(2:1\). Die vollständige Hydrolyse des ursprünglichen Peptids spaltet vier Peptidbindungen:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

Diese Reaktionsgleichungen verwenden neutrale Molekülformen; im stark sauren Hydrolysegemisch sind die Aminogruppen protoniert.

8.2 — Strukturen und Vorteil der Dansylierung

Mit \(R\) sei die Seitenkette des Tyrosins bezeichnet,

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

wobei die phenolische \(\ce{OH}\)-Gruppe para zur \(\ce{CH2}\)-Gruppe steht.

DNFB-Derivat. Das Reagenz ist 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol, Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-].

Der Aminostickstoff ersetzt Fluor durch nucleophile aromatische Substitution. Die Reaktion in neutraler Form lautet:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

Das formale Nebenprodukt ist Fluorwasserstoff, F; eine Base neutralisiert ihn während der Derivatisierung.

Um das Produkt zu zeichnen, verbinden Sie den Aminostickstoff des Tyrosins direkt mit dem Kohlenstoffatom 1 eines Benzolrings, der Nitrogruppen an den Positionen 2 und 4 trägt. Der Stickstoff behält ein Wasserstoffatom, und die phenolische Hydroxygruppe des Tyrosins bleibt in dieser \(N^\alpha\)-markierten Struktur erhalten.

Dansylderivat. Herkömmliches Dansylchlorid, auch 5-(Dimethylamino)naphthalin-1-sulfonylchlorid genannt, hat folgenden SMILES-Code:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

Der Aminostickstoff ersetzt das Chlor am Schwefel unter Bildung eines Sulfonamids:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

Das formale Nebenprodukt ist Chlorwasserstoff, Cl, der ebenfalls durch eine Base neutralisiert wird.

Um herkömmliches Dansyltyrosin zu zeichnen, platzieren Sie die Dimethylaminogruppe am Naphthalin-Kohlenstoffatom 5 und die Sulfonylgruppe am Kohlenstoffatom 1. Letztere besitzt zwei \(\ce{S=O}\)-Bindungen und eine \(\ce{S-NH}\)-Bindung zum Aminostickstoff des Tyrosins.

Bei der Peptidsequenzierung markieren diese Reaktionen den N-terminalen Stickstoff, während der Rest noch Bestandteil des Peptids ist. Die anschließende Hydrolyse setzt die markierte Aminosäure frei.

Der Vorteil der Dansylierung liegt in der starken Fluoreszenz, die einen Nachweis bei wesentlich geringeren Konzentrationen als bei den farbigen Dinitrophenylderivaten ermöglicht.

Die Aufgabenstellung gibt stattdessen 5-(Dimethylamino)naphthalin-4-sulfonyl an. Wörtlich genommen ergibt dies ein anderes Stellungsisomer, bei dem die beiden Substituenten in peri-Stellung zueinander stehen. Das entsprechende \(N^\alpha\)-[5-(Dimethylamino)naphthalin-4-sulfonyl]-L-tyrosin lautet:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — Warum Methionin Leucin ersetzen kann

Die Seitenketten lauten:

\[ \begin{aligned} \text{Leucin:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{Methionin:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

Beide sind flexible, überwiegend hydrophobe Gruppen vergleichbarer Größe. Methionin enthält einen ungeladenen Thioether, der keine geladene Seitenkette einführt.

Der Austausch erhält das Peptidrückgrat und kann ähnliche hydrophobe Kontakte am Rezeptor aufrechterhalten. Daher ist es chemisch plausibel, dass beim Austausch des terminalen Leucins gegen Methionin die schmerzlindernde Wirkung erhalten bleibt.

Die Lösung wurde mit der offiziellen Lösung abgeglichen.

IChO 1984 · Teori sorusu 8

Ağrı kesici bir peptidin amino asit dizisi

PDF indirIChO 1984

Bir peptitteki amino asitlerin dizisi, kimyasal ve enzimatik yöntemlerin birlikte kullanılmasıyla belirlenebilir. Söz konusu peptit, insan vücudunda ağrı kesici olarak işlev görür.

a) Peptidin 6 M \(\ce{HCl}\) içinde \(110^\circ\mathrm{C}\) sıcaklıkta hidroliz edilmesinin ardından açığa çıkan amino asitlerin analizi, Gly, Leu ve aromatik amino asitler Phe, Tyr için 2 : 1 : 1 : 1 mol oranını vermiştir.

b) Peptidin 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) ile tepkimeye sokulmasının ardından hidroliz ve kromatografik analiz yapılmasıyla tirozin türevi elde edilmiştir.

c) Kimotripsin ile kısmi hidroliz sonucunda Leu, Tyr ve daha küçük bir peptit elde edilmiştir. Bu peptidin hidrolizinden sonra Gly ve Phe, 2 : 1 oranında saptanmıştır. Kimotripsin, aromatik bir amino asitten sonra gelen peptit bağını kesen bir proteazdır.

Sorular:

8.1 Verilen bilgilerden amino asit dizisini belirleyiniz.

8.2 Tirozinin DNFB ve dansil türevlerinin yapı formüllerini yazınız. Dansillemenin DNFB ile modifikasyona göre avantajı nedir?

Dansil, 5-N,N-dimetilaminonaftalen-4-sülfonil anlamına gelir.

8.3 Aynı biyolojik aktiviteyi gösteren benzer bir peptitte lösinin yerini metiyonin alır. Her iki amino asidin kimyasal yapısından hareketle bu değişimin biyolojik aktivite kaybı olmadan neden mümkün olduğunu açıklayınız.

Soru metni resmi İngilizce metinden çevrilmiştir.

Cevaplar

8.1 N-ucundan C-ucuna doğru dizi, Leu-enkefalin olarak adlandırılan Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu şeklindedir.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 N-ucundan dizi tayininde kullanılan türevler şunlardır:

Tirozinin amino azotu ile dinitrofenil halkası arasında doğrudan bir bağ bulunan \(N^\alpha\)-(2,4-dinitrofenil)-L-tirozin.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

Sülfonamid bağı içeren \(N^\alpha\)-dansil-L-tirozin. Dansilin yaygın tanımı kullanıldığında:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

Dansil türevleri güçlü floresans gösterir; bu, çok daha duyarlı saptamaya ve dolayısıyla daha az miktarda peptitle dizi tayinine olanak tanır. Basılı metindeki dansil konum numaraları aşağıda ele alınmıştır.

8.3 L-Lösin, N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O, ve L-metiyonin, N[C@@H](CCSC)C(=O)O, benzer hacimlerde, yüksüz ve ağırlıklı olarak hidrofobik yan zincirlere sahiptir. Bu nedenle birinin diğerinin yerini alması, biyolojik aktivite için gerekli etkileşimleri koruyabilir.

Çözüm

8.1 — Dizinin belirlenmesi

Amino asit bileşimi şöyledir:

Kalıntı	Pentapeptitteki sayısı	Serbest amino asit: adı ve SMILES gösterimi
Gly	2	Glisin: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-Lösin: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-Fenilalanin: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-Tirozin: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

DNFB, serbest N-ucundaki amino grubu ile tepkimeye girer. Bu nedenle hidrolizden sonra tirozin türevinin saptanması, Tyr'nin N-ucunda olduğunu gösterir.

Kimotripsin, aromatik bir kalıntının C-ucu tarafındaki bağı keser. Buradaki aromatik kalıntılar Tyr ve Phe'dir.

N-ucundaki Tyr'nin hemen ardından bağın kesilmesi, serbest Tyr açığa çıkarır.
Serbest Leu, C-ucundaki kalıntı olmalıdır: zincirin iç kısmındaki bir Leu, tek bir amino asit olarak açığa çıkamaz; çünkü bunun için Leu'dan sonraki bağın kesilmesi gerekir ve bu, belirtilen özgüllüğe aykırıdır.
Dolayısıyla uçtaki Leu'nun hemen önündeki bağ, aromatik bir kalıntıdan sonra gelmelidir. Tyr zaten N-ucunda olduğundan bu kalıntı Phe'dir.
Geriye kalan parça iki Gly ve bir Phe içerir. Phe bu parçanın sonunda bulunmak zorunda olduğundan dizisi Gly–Gly–Phe şeklindedir.

Böylece bağların kesilme düzeni şöyledir:

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

Daha küçük peptit, glisilglisil-L-fenilalanindir:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

Hidroliz edilen her peptit bağı için bir su, O, molekülü tüketilir. Uçları serbest olan peptitler için dizi kısaltmaları kullanıldığında, denkleştirilmiş enzimatik hidroliz tepkimesi şöyledir:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

Daha küçük peptidin hidrolizi şu ürünleri verir:

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

bu da gözlenen \(2:1\) oranıyla uyumludur. Başlangıçtaki peptidin tam hidrolizinde dört peptit bağı kırılır:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

Bu denkleştirmelerde nötr moleküler biçimler kullanılmıştır; kuvvetli asidik hidroliz karışımında amino grupları protonlanmış hâldedir.

8.2 — Yapılar ve dansillemenin avantajı

\(R\), tirozinin yan zincirini göstersin:

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

burada fenolik \(\ce{OH}\), \(\ce{CH2}\) grubuna göre para konumundadır.

DNFB türevi. Kullanılan reaktif 1-floro-2,4-dinitrobenzen, Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-], bileşiğidir.

Amino azotu, nükleofilik aromatik sübstitüsyon yoluyla florun yerini alır. Nötr biçimler için tepkime şöyledir:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

Biçimsel yan ürün hidrojen florür, F, olup türevlendirme sırasında baz tarafından nötrleştirilir.

Ürünü çizmek için tirozinin amino azotunu, 2 ve 4 konumlarında nitro grupları taşıyan bir benzen halkasının 1 numaralı karbonuna doğrudan bağlayınız. Azot üzerinde bir hidrojen kalır ve bu \(N^\alpha\)-işaretli yapıda tirozinin fenolik hidroksil grubu korunur.

Dansil türevi. Yaygın olarak kullanılan dansil klorür, diğer adıyla 5-(dimetilamino)naftalen-1-sülfonil klorür, şu SMILES gösterimine sahiptir:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

Amino azotu, kükürde bağlı klorun yerini alarak bir sülfonamid oluşturur:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

Biçimsel yan ürün hidrojen klorür, Cl, olup aynı şekilde baz tarafından nötrleştirilir.

Yaygın tanıma uygun dansiltirozini çizmek için dimetilamino grubunu naftalenin 5 numaralı karbonuna, sülfonil grubunu ise 1 numaralı karbonuna yerleştiriniz. Sülfonil grubu iki \(\ce{S=O}\) bağına ve tirozinin amino azotuna uzanan bir \(\ce{S-NH}\) bağına sahiptir.

Peptit dizi tayininde bu tepkimeler, kalıntı hâlâ peptidin bir parçasıyken N-ucundaki azotu işaretler. Ardından yapılan hidroliz, işaretli amino asidi açığa çıkarır.

Dansillemenin avantajı, renkli dinitrofenil türevlerine göre çok daha düşük derişimlerde saptamaya olanak tanıyan güçlü floresansıdır.

Soru metninde ise 5-(dimetilamino)naftalen-4-sülfonil belirtilmiştir. Bu ifade harfiyen alındığında, iki sübstitüentin peri konumlarında olduğu farklı bir konum izomerini verir. Buna karşılık gelen \(N^\alpha\)-[5-(dimetilamino)naftalen-4-sülfonil]-L-tirozin şöyledir:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — Metiyonin neden lösinin yerini alabilir?

Yan zincirler şöyledir:

\[ \begin{aligned} \text{Lösin:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{Metiyonin:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

Her ikisi de benzer büyüklükte, esnek ve ağırlıklı olarak hidrofobik gruplardır. Metiyonin, yan zincire yük kazandırmayan yüksüz bir tiyoeter içerir.

Bu yer değişimi peptit omurgasını korur ve reseptörde benzer hidrofobik temasların sürmesini sağlayabilir. Dolayısıyla uçtaki lösinin metiyoninle değiştirilmesinin ağrı kesici aktiviteyi koruması kimyasal açıdan makuldür.

Çözüm, resmi çözümle karşılaştırılarak kontrol edildi.

IChO 1984 · Problema teórico 8

Secuencia de aminoácidos de un péptido analgésico

Descargar PDFIChO 1984

La secuencia de los aminoácidos de un péptido puede determinarse mediante una combinación de métodos químicos y enzimáticos. El péptido en cuestión actúa en el organismo humano como analgésico.

a) La hidrólisis del péptido en \(\ce{HCl}\) 6 M a \(110^\circ\mathrm{C}\), seguida de un análisis de los aminoácidos liberados, dio como resultado una proporción molar de Gly, Leu y los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr de 2 : 1 : 1 : 1.

b) La reacción del péptido con 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB), seguida de hidrólisis y análisis cromatográfico, produjo el derivado de la tirosina.

c) La hidrólisis parcial con quimotripsina produjo Leu, Tyr y un péptido más pequeño. Tras la hidrólisis de este péptido, se identificaron Gly y Phe en una proporción de 2 : 1. La quimotripsina es una proteasa que escinde un enlace peptídico situado después de un aminoácido aromático.

Cuestiones:

8.1 Determine la secuencia de aminoácidos a partir de la información proporcionada.

8.2 Escriba la fórmula estructural de los derivados de la tirosina obtenidos con DNFB y con dansilo. ¿Qué ventaja presenta la dansilación frente a la modificación con DNFB?

Dansilo significa 5-N,N-dimetilaminonaftaleno-4-sulfonilo.

8.3 En un péptido similar que presenta la misma actividad biológica, la leucina se sustituye por metionina. Explique, a partir de la estructura química de ambos aminoácidos, por qué es posible esta sustitución sin pérdida de actividad biológica.

Enunciado traducido del texto oficial en inglés.

Respuestas

8.1 La secuencia, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, es Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu, denominada Leu-encefalina.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 Los derivados empleados para la secuenciación del extremo N-terminal son:

\(N^\alpha\)-(2,4-dinitrofenil)-L-tirosina, con un enlace directo entre el nitrógeno del grupo amino de la tirosina y el anillo de dinitrofenilo.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-dansil-L-tirosina, con un enlace sulfonamida. Utilizando la definición convencional de dansilo:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

Los derivados dansilados son intensamente fluorescentes, lo que permite una detección mucho más sensible y, por tanto, la secuenciación con cantidades menores de péptido. Los localizadores del dansilo que figuran en el enunciado se examinan más adelante.

8.3 La L-leucina, N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O, y la L-metionina, N[C@@H](CCSC)C(=O)O, tienen cadenas laterales sin carga, predominantemente hidrófobas y de volumen comparable. Por tanto, la sustitución de una por otra puede conservar las interacciones necesarias para la actividad biológica.

Solución

8.1 — Determinación de la secuencia

La composición de aminoácidos es:

Residuo	Número en el pentapéptido	Aminoácido libre: nombre y SMILES
Gly	2	Glicina: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-Leucina: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-Fenilalanina: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-Tirosina: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

El DNFB reacciona con el grupo amino N-terminal libre. Por tanto, la identificación de su derivado de tirosina tras la hidrólisis sitúa a Tyr en el extremo N-terminal.

La quimotripsina escinde el enlace situado en el lado C-terminal de un residuo aromático. En este caso, los residuos aromáticos son Tyr y Phe.

La escisión inmediatamente después de la Tyr N-terminal libera Tyr libre.
La Leu libre debe ser el residuo C-terminal: una Leu interna no podría liberarse como aminoácido individual, ya que esto requeriría una escisión después de Leu, contraria a la especificidad indicada.
En consecuencia, el enlace inmediatamente anterior a la Leu terminal debe estar situado después de un residuo aromático. Tyr ya se encuentra en el extremo N-terminal, por lo que este residuo es Phe.
El fragmento restante contiene dos Gly y una Phe. Puesto que Phe debe ocupar el final de este fragmento, su orden es Gly–Gly–Phe.

Así pues, el patrón de escisión es

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

El péptido más pequeño es la glicilglicil-L-fenilalanina:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

Cada enlace peptídico hidrolizado consume una molécula de agua, O. Utilizando abreviaturas de secuencia para péptidos con extremos libres, la ecuación ajustada de la hidrólisis enzimática es

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

La hidrólisis del péptido más pequeño da

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

de acuerdo con la proporción \(2:1\) observada. La hidrólisis completa del péptido original rompe cuatro enlaces peptídicos:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

Estas ecuaciones ajustadas utilizan formas moleculares neutras; los grupos amino están protonados en la mezcla de hidrólisis fuertemente ácida.

8.2 — Estructuras y ventaja de la dansilación

Sea \(R\) la cadena lateral de la tirosina,

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

con el \(\ce{OH}\) fenólico en posición para respecto al grupo \(\ce{CH2}\).

Derivado del DNFB. El reactivo es el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-].

El nitrógeno del grupo amino sustituye al flúor mediante una sustitución nucleófila aromática. La reacción en forma neutra es

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

El subproducto formal es el fluoruro de hidrógeno, F; una base lo neutraliza durante la derivatización.

Para dibujar el producto, una directamente el nitrógeno del grupo amino de la tirosina al carbono 1 de un anillo de benceno que tenga grupos nitro en las posiciones 2 y 4. El nitrógeno conserva un hidrógeno, y el hidroxilo fenólico de la tirosina sigue presente en esta estructura marcada en \(N^\alpha\).

Derivado dansilado. El cloruro de dansilo convencional, o cloruro de 5-(dimetilamino)naftaleno-1-sulfonilo, tiene el siguiente SMILES:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

El nitrógeno del grupo amino sustituye al cloro unido al azufre, formando una sulfonamida:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

El subproducto formal es el cloruro de hidrógeno, Cl, que también se neutraliza con una base.

Para dibujar la dansiltirosina convencional, coloque el grupo dimetilamino en el carbono 5 del naftaleno y el grupo sulfonilo en el carbono 1. Este último tiene dos enlaces \(\ce{S=O}\) y un enlace \(\ce{S-NH}\) con el nitrógeno del grupo amino de la tirosina.

En la secuenciación de péptidos, estas reacciones marcan el nitrógeno N-terminal mientras el residuo aún forma parte del péptido. La hidrólisis posterior libera el aminoácido marcado.

La ventaja de la dansilación es su intensa fluorescencia, que permite la detección a concentraciones mucho menores que las de los derivados dinitrofenilados coloreados.

El enunciado, en cambio, especifica 5-(dimetilamino)naftaleno-4-sulfonilo. Interpretado literalmente, esto da un isómero de posición diferente, con los dos sustituyentes en posiciones peri. La \(N^\alpha\)-[5-(dimetilamino)naftaleno-4-sulfonil]-L-tirosina correspondiente es:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — Por qué la metionina puede sustituir a la leucina

Las cadenas laterales son

\[ \begin{aligned} \text{Leucina:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{Metionina:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

Ambas son grupos flexibles, predominantemente hidrófobos y de tamaño comparable. La metionina contiene un tioéter sin carga, que no introduce una cadena lateral cargada.

La sustitución conserva el esqueleto peptídico y puede mantener contactos hidrófobos similares en el receptor. Por tanto, es químicamente razonable que la sustitución de la leucina terminal por metionina conserve la actividad analgésica.

La solución se comprobó con la solución oficial.

IChO 1984 · 理论题 8

一种镇痛肽的氨基酸序列

下载 PDFIChO 1984

肽中氨基酸的序列可以通过化学方法与酶法相结合来确定。所研究的肽在人体内具有镇痛作用。

a) 将该肽置于 6 M \(\ce{HCl}\) 中，在 \(110^\circ\mathrm{C}\) 下水解，随后分析释放的氨基酸，得到 Gly、Leu 以及芳香族氨基酸 Phe、Tyr 的摩尔比为 2 : 1 : 1 : 1。

b) 使该肽与 2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，随后进行水解和色谱分析，得到酪氨酸的衍生物。

c) 用胰凝乳蛋白酶进行部分水解，得到 Leu、Tyr 和一个较小的肽。将这个肽水解后，鉴定出 Gly 和 Phe，其比例为 2 : 1。胰凝乳蛋白酶是一种蛋白酶，能够切断芳香族氨基酸之后的肽键。

问题：

8.1 根据所给信息确定氨基酸序列。

8.2 写出酪氨酸的 DNFB 衍生物和丹磺酰衍生物的结构式。与 DNFB 修饰相比，丹磺酰化有什么优点？

丹磺酰指 5-N,N-二甲氨基萘-4-磺酰基。

8.3 在一种具有相同生物活性的类似肽中，亮氨酸被甲硫氨酸取代。从这两种氨基酸的化学结构出发，解释为什么这种替换不会导致生物活性丧失。

题目译自官方英文原文。

答案

8.1 从 N 端到 C 端的序列为 Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu，称为亮氨酸脑啡肽。

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 用于 N 端测序的衍生物为：

\(N^\alpha\)-(2,4-二硝基苯基)-L-酪氨酸，其中酪氨酸的氨基氮原子与二硝基苯环直接成键。

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-丹磺酰-L-酪氨酸，其中含有磺酰胺连接。按照丹磺酰的通常定义：

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

丹磺酰衍生物具有强荧光，可实现灵敏度高得多的检测，因此只需更少量的肽即可进行测序。下文将讨论题目印刷文本中丹磺酰的位次编号。

8.3 L-亮氨酸，N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O，和 L-甲硫氨酸，N[C@@H](CCSC)C(=O)O，均具有不带电、以疏水性为主且体积相近的侧链。因此，二者之间的替换可以保留生物活性所需的相互作用。

解答

8.1 — 序列的确定

氨基酸组成为：

残基	在五肽中的数目	游离氨基酸：名称及 SMILES
Gly	2	甘氨酸：`NCC(=O)O`
Leu	1	L-亮氨酸：`N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-苯丙氨酸：`N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-酪氨酸：`N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

DNFB 与游离的 N 端氨基反应。因此，水解后鉴定出其酪氨酸衍生物，说明 Tyr 位于 N 端。

胰凝乳蛋白酶在芳香族残基的 C 端一侧切断肽键。这里的芳香族残基是 Tyr 和 Phe。

在 N 端 Tyr 紧接其后的肽键处切割，会释放出游离 Tyr。
游离 Leu 必定是 C 端残基：位于肽链内部的 Leu 不可能作为单个氨基酸释放，因为这需要切断 Leu 之后的肽键，与所述酶的专一性不符。
因此，末端 Leu 紧前方的肽键必定位于一个芳香族残基之后。Tyr 已位于 N 端，所以该残基是 Phe。
剩余片段含有两个 Gly 和一个 Phe。由于 Phe 必须位于该片段的末端，其顺序为 Gly–Gly–Phe。

因此，切割模式为

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

较小的肽为甘氨酰甘氨酰-L-苯丙氨酸：

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

每水解一个肽键，就消耗一分子水，O。用序列缩写表示具有游离末端的肽，配平后的酶促水解反应为

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

较小的肽水解得到

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

这与观察到的 \(2:1\) 比例一致。原肽完全水解时，四个肽键断裂：

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

这些配平反应式采用中性分子形式；在强酸性的水解混合物中，氨基会被质子化。

8.2 — 结构及丹磺酰化的优点

用 \(R\) 表示酪氨酸的侧链，

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

其中酚羟基 \(\ce{OH}\) 位于 \(\ce{CH2}\) 基团的对位。

DNFB 衍生物。所用试剂为 1-氟-2,4-二硝基苯，Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-]。

氨基氮原子通过亲核芳香取代反应取代氟原子。以中性形式表示的反应为

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

形式上的副产物为氟化氢，F；在衍生化过程中，碱将其中和。

绘制产物时，将酪氨酸的氨基氮原子直接连接到苯环的 1 位碳原子上，并在苯环的 2 位和 4 位连接硝基。氮原子保留一个氢原子，且在这一 \(N^\alpha\) 标记结构中，酪氨酸的酚羟基仍然存在。

丹磺酰衍生物。通常所指的丹磺酰氯，即 5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯，其 SMILES 为：

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

氨基氮原子取代硫原子上的氯原子，形成磺酰胺：

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

形式上的副产物为氯化氢，Cl，它同样被碱中和。

绘制通常所指的丹磺酰酪氨酸时，将二甲氨基置于萘环的 5 位碳原子上，将磺酰基置于 1 位碳原子上。后者含有两个 \(\ce{S=O}\) 键，并通过一个 \(\ce{S-NH}\) 键与酪氨酸的氨基氮原子相连。

在肽测序中，这些反应在残基仍属于肽链的一部分时标记 N 端氮原子。随后的水解释放出被标记的氨基酸。

丹磺酰化的优点在于其强荧光，使其能够在远低于有色二硝基苯基衍生物所需的浓度下被检测到。

然而，题目指定的是 5-(二甲氨基)萘-4-磺酰基。若按字面理解，这会得到另一种位置异构体，其中两个取代基处于迫位。相应的 \(N^\alpha\)-[5-(二甲氨基)萘-4-磺酰基]-L-酪氨酸为：

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — 为什么甲硫氨酸可以替代亮氨酸

侧链分别为

\[ \begin{aligned} \text{亮氨酸:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{甲硫氨酸:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

二者都是柔性的、以疏水性为主且大小相近的基团。甲硫氨酸含有一个不带电的硫醚基团，不会引入带电侧链。

这种替换保留了肽的主链，并且可以维持与受体之间相似的疏水接触。因此，用甲硫氨酸替换末端亮氨酸后仍能保留镇痛活性，在化学上是合理的。

解答已与官方解答核对。

IChO 1984 · Теоретическая задача 8

Аминокислотная последовательность пептида с обезболивающим действием

Скачать PDFIChO 1984

Последовательность аминокислот в пептиде можно определить с помощью сочетания химических и ферментативных методов. Рассматриваемый пептид действует в организме человека как обезболивающее средство.

a) Гидролиз пептида в 6 М \(\ce{HCl}\) при \(110^\circ\mathrm{C}\) с последующим анализом высвободившихся аминокислот показал, что молярное соотношение Gly, Leu и ароматических аминокислот Phe, Tyr составляет 2 : 1 : 1 : 1.

b) При взаимодействии пептида с 2,4-динитрофторбензолом (DNFB) с последующим гидролизом и хроматографическим анализом было получено производное тирозина.

c) При частичном гидролизе под действием химотрипсина были получены Leu, Tyr и пептид меньшего размера. После гидролиза этого пептида были обнаружены Gly и Phe в соотношении 2 : 1. Химотрипсин — протеаза, расщепляющая пептидную связь после ароматической аминокислоты.

Задания:

8.1 Определите аминокислотную последовательность на основании приведённых данных.

8.2 Напишите структурные формулы производного тирозина, полученного с помощью DNFB, и дансильного производного тирозина. В чём преимущество дансилирования по сравнению с модификацией с помощью DNFB?

Дансил означает 5-N,N-диметиламинонафталин-4-сульфонил.

8.3 В аналогичном пептиде, обладающем такой же биологической активностью, лейцин заменён метионином. Исходя из химического строения обеих аминокислот, объясните, почему такая замена возможна без потери биологической активности.

Условие переведено с официального английского текста.

Ответы

8.1 Последовательность от N-конца к C-концу — Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu; этот пептид называется лейцин-энкефалином.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 Производные, используемые для определения последовательности с N-конца:

\(N^\alpha\)-(2,4-динитрофенил)-L-тирозин, в котором атом азота аминогруппы тирозина непосредственно связан с динитрофенильным кольцом.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-дансил-L-тирозин, содержащий сульфонамидную связь. При использовании общепринятого определения дансила:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

Дансильные производные обладают интенсивной флуоресценцией, что обеспечивает гораздо более высокую чувствительность обнаружения и, следовательно, позволяет определять последовательность при меньших количествах пептида. Приведённые в условии локанты дансила рассматриваются ниже.

8.3 L-Лейцин, N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O, и L-метионин, N[C@@H](CCSC)C(=O)O, имеют незаряженные, преимущественно гидрофобные боковые цепи сопоставимого объёма. Поэтому замена одной аминокислоты другой может сохранять взаимодействия, необходимые для биологической активности.

Решение

8.1 — Определение последовательности

Аминокислотный состав:

Остаток	Число остатков в пентапептиде	Свободная аминокислота: название и SMILES
Gly	2	Глицин: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-Лейцин: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-Фенилаланин: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-Тирозин: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

DNFB реагирует со свободной N-концевой аминогруппой. Поэтому обнаружение его производного тирозина после гидролиза указывает на то, что Tyr находится на N-конце.

Химотрипсин расщепляет связь с C-концевой стороны ароматического остатка. В данном случае ароматические остатки — Tyr и Phe.

Расщепление непосредственно после N-концевого Tyr высвобождает свободный Tyr.
Свободный Leu должен быть C-концевым остатком: внутренний остаток Leu не мог бы высвободиться в виде отдельной аминокислоты, поскольку для этого потребовалось бы расщепление после Leu, что противоречит указанной специфичности.
Следовательно, связь непосредственно перед концевым Leu должна находиться после ароматического остатка. Tyr уже находится на N-конце, поэтому этим остатком является Phe.
Оставшийся фрагмент содержит два остатка Gly и один остаток Phe. Поскольку Phe должен завершать этот фрагмент, его последовательность — Gly–Gly–Phe.

Таким образом, схема расщепления имеет вид

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

Пептид меньшего размера — глицилглицил-L-фенилаланин:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

При гидролизе каждой пептидной связи расходуется одна молекула воды, O. Если использовать сокращённые обозначения последовательностей пептидов со свободными концевыми группами, уравнение ферментативного гидролиза с расставленными коэффициентами имеет вид

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

Гидролиз пептида меньшего размера даёт

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

что согласуется с наблюдаемым соотношением \(2:1\). При полном гидролизе исходного пептида расщепляются четыре пептидные связи:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

В этих уравнениях использованы нейтральные молекулярные формы; в сильнокислой смеси, в которой проводится гидролиз, аминогруппы протонированы.

8.2 — Структуры и преимущество дансилирования

Обозначим боковую цепь тирозина через \(R\):

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

причём фенольная группа \(\ce{OH}\) находится в пара-положении по отношению к группе \(\ce{CH2}\).

Производное DNFB. Реагент — 1-фтор-2,4-динитробензол, Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-].

Атом азота аминогруппы замещает фтор в результате нуклеофильного ароматического замещения. Уравнение реакции для нейтральных форм имеет вид

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

Формальный побочный продукт — фтороводород, F; при получении производного он нейтрализуется основанием.

Чтобы изобразить продукт, соедините атом азота аминогруппы тирозина непосредственно с атомом углерода 1 бензольного кольца, несущего нитрогруппы в положениях 2 и 4. У атома азота сохраняется один атом водорода, а фенольный гидроксил тирозина остаётся в этой структуре, меченной по \(N^\alpha\).

Дансильное производное. Общепринятый дансилхлорид, или хлорид 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонила, имеет следующую запись SMILES:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

Атом азота аминогруппы замещает хлор при атоме серы с образованием сульфонамида:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

Формальный побочный продукт — хлороводород, Cl, который также нейтрализуется основанием.

Чтобы изобразить общепринятую структуру дансилтирозина, расположите диметиламиногруппу при атоме углерода 5 нафталина, а сульфонильную группу — при атоме углерода 1. Последняя содержит две связи \(\ce{S=O}\) и связь \(\ce{S-NH}\) с атомом азота аминогруппы тирозина.

При определении последовательности пептида эти реакции метят N-концевой атом азота, пока остаток ещё входит в состав пептида. Последующий гидролиз высвобождает меченую аминокислоту.

Преимущество дансилирования заключается в интенсивной флуоресценции, позволяющей обнаруживать производные при гораздо меньших концентрациях, чем окрашенные динитрофенильные производные.

В условии, однако, указан 5-(диметиламино)нафталин-4-сульфонил. При буквальном прочтении это другой позиционный изомер, в котором два заместителя находятся в пери-положениях. Соответствующий \(N^\alpha\)-[5-(диметиламино)нафталин-4-сульфонил]-L-тирозин имеет вид:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — Почему метионин может заменять лейцин

Боковые цепи имеют вид

\[ \begin{aligned} \text{Лейцин:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{Метионин:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

Обе представляют собой гибкие, преимущественно гидрофобные группы сопоставимого размера. Метионин содержит незаряженную тиоэфирную группу, которая не придаёт боковой цепи заряда.

Замена сохраняет пептидный остов и может обеспечивать сходные гидрофобные контакты с рецептором. Таким образом, с химической точки зрения вполне обоснованно, что замена концевого лейцина метионином сохраняет обезболивающую активность.

Решение проверено по официальному решению.

IChO 1984 · مسألة نظرية 8

تسلسل الأحماض الأمينية في ببتيد مسكّن للألم

تنزيل PDFIChO 1984

يمكن تحديد تسلسل الأحماض الأمينية في ببتيد بالجمع بين الطرائق الكيميائية والإنزيمية. ويعمل الببتيد المعني في جسم الإنسان بوصفه مسكّنًا للألم.

a) أدّى التحلّل المائي للببتيد في محلول من \(\ce{HCl}\) تركيزه 6 M عند \(110^\circ\mathrm{C}\)، ثم تحليل الأحماض الأمينية المتحرّرة، إلى الحصول على نسبة مولية بين Gly وLeu والحمضين الأمينيين العطريين Phe وTyr مقدارها 2 : 1 : 1 : 1.

b) أدّى تفاعل الببتيد مع 2,4-ثنائي نيترو فلوروبنزين (DNFB)، ثم التحلّل المائي والتحليل الكروماتوغرافي، إلى الحصول على مشتق التيروزين.

c) أعطى التحلّل المائي الجزئي بالكيموتريبسين Leu وTyr وببتيدًا أصغر. وبعد التحلّل المائي لهذا الببتيد، جرى التعرّف على Gly وPhe بنسبة 2 : 1. والكيموتريبسين إنزيم محلّل للبروتين يشطر الرابطة الببتيدية التي تلي حمضًا أمينيًا عطريًا.

المطلوب:

8.1 حدّد تسلسل الأحماض الأمينية استنادًا إلى المعلومات المعطاة.

8.2 اكتب الصيغة البنائية لكلٍّ من مشتق DNFB ومشتق الدانسيل للتيروزين. ما ميزة الدنسلة مقارنةً بالتعديل باستخدام DNFB؟

يشير الدانسيل إلى 5-N,N-ثنائي ميثيل أمينو نفثالين-4-سلفونيل.

8.3 في ببتيد مشابه يُظهر النشاط الحيوي نفسه، يُحَلّ الميثيونين محلّ الليوسين. فسّر، انطلاقًا من البنية الكيميائية لكلا الحمضين الأمينيين، لماذا يمكن إجراء هذا الاستبدال دون فقدان النشاط الحيوي.

نص المسألة مترجم عن النص الإنجليزي الرسمي.

الإجابات

8.1 التسلسل، من النهاية N إلى النهاية C، هو Tyr–Gly–Gly–Phe–Leu، ويُسمّى ليو-إنكيفالين.

SMILES: N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O

8.2 المشتقان المستخدمان لتحديد التسلسل من النهاية N هما:

\(N^\alpha\)-(2,4-ثنائي نيتروفينيل)-L-تيروزين، وفيه رابطة مباشرة بين نيتروجين المجموعة الأمينية للتيروزين وحلقة ثنائي نيتروفينيل.

SMILES: N(c1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-])[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O

\(N^\alpha\)-دانسيل-L-تيروزين، وفيه رابطة سلفوناميدية. وباستخدام التعريف المتعارف عليه للدانسيل:

SMILES: CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)cccc12

تتميّز مشتقات الدانسيل بفلورة قوية، مما يتيح الكشف بحساسية أعلى بكثير، ومن ثم تحديد التسلسل باستخدام كميات أصغر من الببتيد. وتُناقَش أدناه أرقام المواضع الواردة للدانسيل في النص المطبوع.

8.3 يمتلك L-ليوسين، N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O، وL-ميثيونين، N[C@@H](CCSC)C(=O)O، سلسلتين جانبيتين غير مشحونتين، يغلب عليهما الطابع الكاره للماء، ومتقاربتين في الحيّز الفراغي. ولذلك يمكن لاستبدال أحدهما بالآخر أن يحافظ على التآثرات اللازمة للنشاط الحيوي.

الحل

8.1 — تحديد التسلسل

تركيب الأحماض الأمينية هو:

البقية	عددها في الببتيد الخماسي	الحمض الأميني الحر: الاسم وSMILES
Gly	2	غليسين: `NCC(=O)O`
Leu	1	L-ليوسين: `N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O`
Phe	1	L-فينيل ألانين: `N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O`
Tyr	1	L-تيروزين: `N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O`

يتفاعل DNFB مع المجموعة الأمينية الحرة عند النهاية N. ولذلك فإن التعرّف على مشتق التيروزين الناتج عنه بعد التحلّل المائي يحدّد موضع Tyr عند النهاية N.

يشطر الكيموتريبسين الرابطة الواقعة على الجانب المتجه نحو النهاية C من بقية حمض أميني عطري. والبقيتان العطريتان هنا هما Tyr وPhe.

يؤدّي الشطر مباشرةً بعد Tyr الموجود عند النهاية N إلى تحرير Tyr حر.
يجب أن يكون Leu الحر هو البقية الموجودة عند النهاية C: إذ لا يمكن تحرير Leu داخلي على هيئة حمض أميني منفرد، لأن ذلك يتطلّب الشطر بعد Leu، خلافًا للنوعية المحدّدة للإنزيم.
ومن ثم، يجب أن تلي الرابطة الواقعة مباشرةً قبل Leu الطرفي بقيةً عطرية. وبما أن Tyr موجود بالفعل عند النهاية N، فإن هذه البقية هي Phe.
تحتوي القطعة المتبقية على بقيتين من Gly وبقية واحدة من Phe. ولأن Phe يجب أن يقع في نهاية هذه القطعة، فإن ترتيبها هو Gly–Gly–Phe.

وعليه، يكون نمط الشطر هو

\[ \boxed{\mathrm{Tyr}\downarrow\mathrm{Gly-Gly-Phe}\downarrow\mathrm{Leu}}. \]

الببتيد الأصغر هو غليسيل غليسيل-L-فينيل ألانين:

NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)O

تستهلك كل رابطة ببتيدية تخضع للتحلّل المائي جزيئًا واحدًا من الماء، O. وباستخدام اختصارات التسلسل للببتيدات ذات النهايات الحرة، تكون معادلة التحلّل المائي الإنزيمي الموزونة هي

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 2 H2O ->[chymotrypsin] Tyr + Gly-Gly-Phe + Leu}. \]

يعطي التحلّل المائي للببتيد الأصغر

\[ \ce{Gly-Gly-Phe + 2 H2O -> 2 Gly + Phe}, \]

وهو ما يتفق مع النسبة المرصودة \(2:1\). ويؤدّي التحلّل المائي الكامل للببتيد الأصلي إلى كسر أربع روابط ببتيدية:

\[ \ce{Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu + 4 H2O ->[HCl,\ 110 ^\circ C] Tyr + 2 Gly + Phe + Leu}. \]

تستخدم هذه المعادلات الموزونة الأشكال الجزيئية المتعادلة؛ وتكون المجموعات الأمينية مبرتنة في مزيج التحلّل المائي الشديد الحموضة.

8.2 — البنى وميزة الدنسلة

ليرمز \(R\) إلى السلسلة الجانبية للتيروزين،

\[ R=\ce{CH2-C6H4-OH}, \]

حيث تقع مجموعة \(\ce{OH}\) الفينولية في الموضع بارا بالنسبة إلى مجموعة \(\ce{CH2}\).

مشتق DNFB. الكاشف هو 1-فلورو-2,4-ثنائي نيتروبنزين، Fc1ccc([N+](=O)[O-])cc1[N+](=O)[O-].

يحلّ نيتروجين المجموعة الأمينية محلّ الفلور بتفاعل استبدال عطري محبّ للنواة. ويكون التفاعل بالأشكال المتعادلة كما يلي

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + F-C6H3(NO2)2 -> (NO2)2C6H3-NH-CH(R)-COOH + HF}. \]

الناتج الجانبي الصوري هو فلوريد الهيدروجين، F؛ وتقوم قاعدة بمعادلته أثناء تكوين المشتق.

لرسم الناتج، اربط نيتروجين المجموعة الأمينية للتيروزين مباشرةً بذرة الكربون 1 من حلقة بنزين تحمل مجموعتي نيترو في الموضعين 2 و4. ويحتفظ النيتروجين بذرة هيدروجين واحدة، وتبقى مجموعة الهيدروكسيل الفينولية للتيروزين موجودة في هذه البنية الموسومة عند \(N^\alpha\).

مشتق الدانسيل. إن كلوريد الدانسيل المتعارف عليه، أو كلوريد 5-(ثنائي ميثيل أمينو)نفثالين-1-سلفونيل، له ترميز SMILES الآتي:

CN(C)c1cccc2c(S(=O)(=O)Cl)cccc12

يحلّ نيتروجين المجموعة الأمينية محلّ الكلور عند ذرة الكبريت، مكوّنًا سلفوناميدًا:

\[ \ce{H2N-CH(R)-COOH + (CH3)2N-C10H6-SO2Cl -> (CH3)2N-C10H6-SO2-NH-CH(R)-COOH + HCl}. \]

الناتج الجانبي الصوري هو كلوريد الهيدروجين، Cl، الذي تُعادله قاعدة كذلك.

لرسم دانسيل تيروزين المتعارف عليه، ضع مجموعة ثنائي ميثيل أمينو عند ذرة الكربون 5 في النفثالين، ومجموعة السلفونيل عند ذرة الكربون 1. وتحتوي المجموعة الأخيرة على رابطتي \(\ce{S=O}\) ورابطة \(\ce{S-NH}\) مع نيتروجين المجموعة الأمينية للتيروزين.

في تحديد تسلسل الببتيدات، تسم هذه التفاعلات نيتروجين النهاية N بينما لا تزال البقية جزءًا من الببتيد. ويحرّر التحلّل المائي اللاحق الحمض الأميني الموسوم.

تكمن ميزة الدنسلة في الفلورة القوية، التي تتيح الكشف عند تراكيز أقل بكثير من تلك اللازمة لمشتقات ثنائي نيتروفينيل الملوّنة.

لكن نص المسألة يحدّد 5-(ثنائي ميثيل أمينو)نفثالين-4-سلفونيل. وإذا أُخذ ذلك حرفيًا، فإنه يعطي متماكبًا موضعيًا مختلفًا، تقع فيه المجموعتان المستبدلتان في موضعَي بيري. ويكون \(N^\alpha\)-[5-(ثنائي ميثيل أمينو)نفثالين-4-سلفونيل]-L-تيروزين الموافق كما يلي:

CN(C)c1cccc2cccc(S(=O)(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)O)c12

8.3 — لماذا يمكن أن يحلّ الميثيونين محلّ الليوسين

السلسلتان الجانبيتان هما

\[ \begin{aligned} \text{الليوسين:}&\qquad \ce{-CH2-CH(CH3)2},\\ \text{الميثيونين:}&\qquad \ce{-CH2-CH2-S-CH3}. \end{aligned} \]

كلتاهما مجموعتان مرنتان، يغلب عليهما الطابع الكاره للماء، ومتقاربتان في الحجم. ويحتوي الميثيونين على ثيوإيثر غير مشحون، لا يُدخل شحنة على السلسلة الجانبية.

يحافظ الاستبدال على الهيكل الأساسي للببتيد، ويمكنه الحفاظ على تآثرات كارهة للماء مماثلة عند المستقبِل. ولذلك فمن المعقول كيميائيًا أن يحافظ إحلال الميثيونين محلّ الليوسين الطرفي على النشاط المسكّن للألم.

تمت مراجعة الحل بمقارنته بالحل الرسمي.